超声微波协同制备粗毛纤孔菌多糖及体外降脂作用的研究（一）

随着生活质量的超声粗毛提高，人们日常生活中对高脂、微波高糖、协同纤孔高能量饮食的制备作用摄入增加，导致高血脂症患病人群数量增加，菌多降脂究高血脂症已成为世界关注的糖及体外重点问题。预防与治疗高脂血症的超声粗毛方法有运动锻炼、控制饮食和药物治疗等方式，微波其中药物治疗方式效果虽好，协同纤孔但是制备作用有毒副作用。有研究表明天然产物中含有许多降血脂的菌多降脂究物质，从天然产物中开发降血脂的糖及体外物质成为当今研究热点。

粗毛纤孔菌Inonotushispidus（Bull.）Pat.，超声粗毛又名粗毛黄褐孔菌，微波是协同纤孔一种非常珍贵的药用真菌。粗毛纤孔菌作为一种药用真菌，具有抗肿瘤、抑菌、抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物活性。目前已经从粗毛纤孔菌中分离得到多种具有生物活性的化合物，包括多糖类、三萜类和酚类等。多糖作为粗毛纤孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等作用。但提取方法对有效活性成分的提取效果以及活性的影响很大。张倩等研究热水浸提和超声微波协同提取对枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影响，结果表明超声微波协同法得到的枸杞多糖提取率显著高于热水浸提法，且超声微波协同法得到的多糖对自由基的清除能力比热水浸提法更好。苏平等研究四种不同辅助提取方法对黄秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影响，四种方法对比发现酶法提取的黄秋葵花多糖提取率最高，四种方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超声辅助提取的多糖表现出更强的抗氧化活性。马舒伟等研究不同方法对玄参多糖单糖组分和抗氧化活性的影响，不同方法提取的玄参多糖对比发现，酶辅助提取法提取的玄参多糖的纯度最高，体外抗氧化活性最强。

超声微波协同辅助提取法充分利用了超声波震动的空化作用与微波的高能效应和热效应，将超声微波相结合，既能缩短提取时间，又可以提高提取效率，从而实现高效快速的处理样品，有学者采用微波超声组合提取猴头菇多糖与热水提取法、超声波提取法和微波提取法相比，发现微波超声联用组合具有节省时间和多糖浸出率高等优点。因此为提高粗毛纤孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken试验设计研究了超声微波协同制备粗毛纤孔菌多糖的工艺，并与微波辅助提取法和热水提取法对比分析了粗毛纤孔菌多糖提取率及体外胆酸盐结合能力，以期为把粗毛纤孔菌多糖开发成为一种降脂功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗毛纤孔菌子实体于2020年9月采自东北林业大学林场；葡萄糖、浓硫酸、苯酚国产分析纯；甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）上海源叶生物生物科技有限公司。Scientz-IIDM型微波光波超声波萃取仪宁波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；722s型紫外分光光度计上海第三分析仪器厂；RE-52型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器公司；SHB-Ⅲ型循环水真空泵郑州长城科工贸有限公司；GL10048型万分之分析天平上海佑科仪器仪表有限公司；TDL40BW型台式离心机上海星科科学仪器有限公司；HH-4型电热恒温水槽上海力辰仪器科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料处理

将采摘的新鲜粗毛纤孔菌子实体于烘箱中60℃烘干，高速粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

1.2.2 超声微波协同制备粗毛纤孔菌子实体多糖工艺

1.2.2.1 单因素实验

准确称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，加入一定体积的蒸馏水，充分搅拌后放置微波光波超声波萃取仪中，固定实验参数料液比1:30g:mL，超声时间30min，超声功率200W，微波时间30s，微波功率300W，分别考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g:mL），超声时间（10、20、30、40、50、60min）、超声功率（100、200、300、400、500W）、微波时间（10、20、30、40、50、60s）、微波功率（100、200、300、400、500、600W）对超声微波辅助提取粗毛纤孔菌多糖提取率的影响，将制备得到的多糖提取液在4000r/min离心15min，上清液即为粗毛纤孔菌子实体多糖溶液，残渣按上述步骤复提两次，合并提取液。在旋转蒸发仪上60℃旋转蒸发至原体积的1/4，冷却后测多糖含量。得出五个单因素对IHP提取率的影响，最终根据单因素实验结果确定响应面试验的因素和水平。

1.2.2.2 响应面设计

根据单因素的实验结果，使用Design-Expert8.0软件进行响应面试验设计，因素水平表见表1。根据响应面试验结果，建立数学模型，确定IHP的最佳提取条件。

1.2.3 不同提取方法对粗毛纤孔菌多糖提取率的影响

将优化后的超声微波辅助法对IHP的提取率与热水浸提法和超声辅助法进行对比。超声微波辅助提取法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，置于放置微波光波超声波萃取仪中，设定超声时间51min，超声功率200W，微波时间50s，微波功率500W进行提取，离心取上清液，测多糖含量。热水浸提法和超声辅助法采用预实验优化得到的工艺条件。热水浸提法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，60℃水浴浸提3h，提取结束后，离心取上清液，测多糖含量。超声辅助法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，置于放置微波光波超声波萃取仪中，设置超声功率200W，超声时间1h，提取结束后，离心取上清液，测多糖含量。

1.2.4 粗毛纤孔菌多糖含量的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的制作

采用苯酚-硫酸法测定糖含量[21]准确称取经真空干燥恒重的葡萄糖40mg，于500mL容量瓶中定容配制成80μg/mL的葡萄糖标准液，取2.0mL蒸馏水为空白样，用移液枪依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL葡萄糖标准液于具塞试管，各管补加蒸馏水至2.0mL，加入6%苯酚1mL，98%浓硫酸5mL，静置10min后振荡混匀，室温下静置20min后，充分反应，于490nm下测定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标作葡萄糖标准曲线。得到的线性回归方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于计算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的测定

准确吸取2mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0mL和98%浓硫酸5.0mL，静置10min后振荡混匀，在室温下放置20min，于490nm下测定OD值。若测得样品多糖浓度不在测量范围内，应当稀释再次测量。粗毛纤孔菌多糖的提取率为提取液中的多糖与总多糖的比值，在预实验中，采用热水法反复多次提取确定了粗毛纤孔菌子实体多糖含量为16.4%。提取率计算公式为：

式中：C为根据标准曲线计算得到的粗毛纤孔菌水提液液所含多糖的质量浓度，μg/mL；V为粗毛纤孔菌水提液总体积，mL；N为溶液最终的稀释倍数；k为粗毛纤孔菌子实体粉末的重量，g；m为1g粗毛纤孔菌子实体粉末总多糖含量，%。

1.2.5 体外降脂实验

1.2.5.1 胆酸盐标准曲线的绘制

胆酸盐测定方法参照文献分别取不同浓度的胆酸盐标准溶液（甘氨胆酸钠0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3mmol/L，牛磺胆酸钠0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mmol/L），2mL于具塞试管中，向每管标准溶液中依次加入6mL质量分数60%的H₂SO₄，70℃恒温水浴锅中水浴20min，取出后进行冰浴5min，在387nm处测定吸光度，分别作两种胆酸盐标准曲线，计算回归方程，牛黄胆酸钠的回归方程为y=2.8591x-0.0176，R²=0.9957，可以用于计算牛磺胆酸钠含量。甘氨胆酸钠的回归方程为y=1.5012x+0.0536，R²=0.9957，可以用于计算甘氨胆酸钠含量。

1.2.5.2 粗毛纤孔菌多糖胆酸盐结合能力的测定

粗毛纤孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4℃醇沉24h，离心，去除上清液，沉淀即为粗毛纤孔菌粗多糖，将粗多糖用蒸馏水配制成20mg/mL多糖溶液分别吸取1mL粗毛纤孔菌粗多糖溶液于100mL具塞三角瓶中，加入1mL10mg/mL胃蛋白酶，3mL0.01mol/L的HCl溶液，在37℃恒温振荡，模拟胃环境（pH为1.5）消化1h；以0.1mol/L的NaOH溶液调节溶液pH至6.3，再加入4mL10mg/mL胰蛋白酶，模拟肠道环境进行消化1h，加入4mL1mmol/L胆酸盐消化1h，4000r/min离心20min，取上清液，比色测定胆酸盐含量，平行3次实验。甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率按下式计算。

式中：c₁为甘氨胆酸钠加入量，μmol，c₂为甘氨胆酸钠剩余量，μmol，c₃为牛磺胆酸钠加入量，μmol，c₄为牛磺胆酸钠剩余量，μmol。

1.3 数据处理

实验重复三次，试验中的数据运用SPSS17.0软件进行方差分析（analysisofvariance，ANOVA）单因素方差分析，数据以表示，组间做t检验，P＜0.05则表示有显著性差异，有统计学意义。

相关链接：硫酸，牛磺胆酸钠，胃蛋白酶，胰蛋白酶

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